các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing
(µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã
tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng
dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing
(µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ [7].
In kim (Contact-tip deposition printing)
Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên
cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim
nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên
bề mặt của cơ chất (Hình 2). Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc [13].
▲Hình 2: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing [Theo 7].
Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch. Phương
pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích
thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm
2
[7].
In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing)
Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane
(PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 3). Trên thực tế, kỹ thuật này không
sản xuất thành công các mảng mật độ cao [7].
▲Hình 3: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing [Theo 7].
In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network)
µFN là kỹ thuật µCP cải tiến. Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thuỷ
tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide. Dung dịch cơ chất chứa đầy trong
những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản (Hình 4).
▲Hình 4: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN [Theo 7].
Giống như µCP, tính khả thi của µFN để sản xuất các DNA array đang được chứng minh [7].
In mạ (Electro capture)
Các array này giống như một con chip silicon. Giá thể ở đây là silicon có lớp bề mặt bị ôxi hoá
bởi nhiệt. Ở những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực platin dày 500 nm. Sau đó
tiến hành một loạt các biến đổi hoá học có thứ tự để tạo ra chip gồm nhiều lớp. Toàn bộ chip
trừ phần không gian của điện cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si
3
N
4
dày 2 mm,
bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ
bởi lớp Si
3
N
4
. Trên cùng của chip là lớp streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit
nucleic đã biotin hoá (Hình 5).
▲Hình 5: In mạ [Theo 7].
Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin
hoá [7]. Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng
điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 6). Hiện tại, chip với trên 400 điện cực đang phát
triển trong các phân tích di truyền (http://www.nanogen.com).
▲Hình 6: Sơ đồ chip electric silicon. (A) Sơ đồ chip có 25 điện cực platin, chiều dài mỗi cạnh
1 cm. Phần ngoại biên của chip có các điện cực platin (ô vuông màu sáng) để nối chip với
nguồn điện. Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng chạy giữa điện cực ngoại biên và
điện cực nhỏ hơn ở trung tâm. (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm. Vùng này chứa điện
cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông. (C) Vùng điện
cực [Theo 7].
In quang hoạt (Photolithography)
Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in
situ trên giá thể rắn [14]. Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn [15].
Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân huỷ bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn.
Dùng mặt nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm
bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại
bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 7). Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ
và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại
những vị trí xác định trên cơ chất [14]. Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác
nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm (http://www.affymetrix.com).
In áp điện (Piezoelectric printing)
In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ
dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường [16]. Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu
phân phối (hình 8). Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000
chấm/cm
2
.
Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân
phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng
hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 9) [16].
▲Hình 7: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt [Theo 16].
▲Hình 8: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp
[Theo 7].
▲Hình 9: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ tục nhiều ống
phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá [Theo 7].
In vi lỏng (µWP - Micro wet printing)
Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để
định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng. Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thuỷ
tinh tạo thành hệ thống kênh. Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong
hộp mực. Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số
vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ. Khi dung dịch
oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết
thúc một chu kỳ (hình 10). Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và vị trí
mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất. Hệ
thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như
protein hoặc kháng thể.
▲Hình 10: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng [Theo 7].
2.2.2 Tiến hành thí nghiệm
Về cơ bản, các bước tiến hành thí nghiệm với microarray là như nhau và gồm 3 bước: (i) chuẩn
bị mẫu; (ii) tiến hành lai; (iii) xác định tín hiệu và chuẩn hoá dữ liệu.
Chuẩn bị mẫu
Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu. Mẫu để lai
(đích) có thể là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau
khi lai. Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm
tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực
tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi
đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là
chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (
32
P,
33
P,
35
S),
chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và nhuộm vàng/bạc
[7]. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất [17].
Tiến hành lai
Sau khi đánh dấu, tiến hành lai trên mảng. Do sử dụng chất mang rắn nên phương pháp
microarray dễ tiến hành hơn các phương pháp blot. Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã
đánh dấu đi qua mảng. Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích. Nếu dùng chất mang
thuỷ tinh, có thể đặt úp một phiến kính thuỷ tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe
trống giữa chúng bởi lực mao dẫn [1]. Một cách đơn giản khác là đặt trực tiếp mảng trong bể
nhỏ chứa dung dịch lai. Các điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn
vào kích thước mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm [17]. Hiệu quả lai
có thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trong trạng thái động so với bề mặt mảng [1].
▲Hình 11: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 [Theo Yu et al., 2002].
Xác định và phân tích tín hiệu lai
Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu
dò [9]. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra.
Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 12).
Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên
một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu,
trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy
tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và
chính xác.
Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng
với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng.
▲Hình 12: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng.
Mảng chứa mẫu dò cDNA
Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có
kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau. Mỗi mẫu được đánh dấu một
loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 13). Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát
huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp
nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu [18].
Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối
chứng cho mỗi phiến kính. (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra
hiện tượng lai chéo [19]. (iii) Không phân biệt được các gene liên quan gần và các gene khác
nhau một nucleotide. (iv) Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu. Hơn nữa, hai loại chất
phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ). Do đó, cần
phải chuẩn hoá dữ liệu [20]. (v) Không có khả năng định lượng. (vi) Cần lượng lớn đích [9].
Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo. (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự [9]. (iii)
Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu
[21]. (iv) Tính đặc hiệu cao [21].
▲Hình 13: Thủ tục lai sử dụng mẫu dò cDNA.
Mảng chứa mẫu dò oligonucleotide
Các chip tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gene khác nhau, mỗi gene được đại diện
bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 “cặp mẫu dò” khác nhau [22]. Do phương pháp này không
sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính xác và
loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã nghĩ ra mô mẫu dò bắt cặp không hoàn hảo/hoàn hảo
(MM/PM). Oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ
một base chính giữa (hình 15). So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu
gắn. Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau nên không
được dùng để đánh giá. Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì cường độ tín hiệu lai
MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu. Tất cả các vùng khác có kết quả lai đặc
hiệu và là đối tượng phân tích.
Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng nhất và có thể
so sánh hiệu quả. (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần. (iii) Có khả năng định lượng. (iv)
Cần lượng nhỏ đích [9]. (v) Mật độ mẫu dò lớn cho phép phân tích nhiều gen hơn trên một
array [21]. (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng
hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như
PCR, tách dòng… do đó tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai
dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot [14].
▲Hình 14: Thủ tục lai dùng mẫu dò tổng hợp in situ.
Nhược điểm: (i) Các trình tự được chọn dựa ngân hàng gene nên có thể phải chỉnh sửa. (ii)
Mẫu dò ngắn làm giảm độ nhạy và tính đặc hiệu. (iii) Không thể so sánh đồng thời sự biểu hiện
gene của hai mẫu thí nghiệm liên quan trên cùng một mảng [21; 23].
▲Hình 15: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM [Theo 14].
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường
Mặc dù microarray ra đời mở ra một kỷ nguyên mới trong rất nhiều lĩnh vực, song khi ứng
dụng trong môi trường nó gặp phải một số vấn đề.
Vấn đề kỹ thuật
Tồn tại cố hữu của phương pháp microarray là các điều kiện lai (nhiệt độ, nồng độ muối…)
không bao giờ tối ưu cho mọi phân tử, dẫn đến hiệu quả lai không đặc hiệu hoặc không hoàn
toàn và kết quả sẽ thiếu chính xác.
Vấn đề quan trọng khi áp dụng kỹ thuật microarray với mẫu môi trường liên quan đến các biến
đổi khác nhau của dấu hiệu lai do mật độ và trình tự khác nhau [24]. Tính đa dạng di truyền rất
lớn trong môi trường tác động đến cả việc chế tạo mảng và giải thích dữ liệu. Tính đa dạng
trình tự gene cấu trúc trong các quần thể liên quan về mặt chức năng (như vi khuẩn cố định
nitơ, khử sulfate hay nitrat hoá) lớn làm khả năng tính toán của máy tính hiện khó đáp ứng nổi,
đặc biệt khi sử dụng các mẫu dò oligonucleotide ngắn [25]. Hơn nữa, hiệu quả của microarray
với các mẫu môi trường khác nhau có tương tự với mẫu chủng đơn hay không là một vấn đề
khó đánh giá [6; 26].
Một điều đặc biệt quan trọng là khi lai cùng lúc hàng trăm hoặc hàng ngàn mẫu dò trên mảng sẽ
làm tăng khả năng lai chéo giữa các trình tự không liên quan [27]. Tín hiệu lai khác nhau phản
ánh khá xác thực độ khác nhau giữa các mẫu tuy nhiên, khi kết quả lai giống nhau không có
nghĩa là những mẫu này giống nhau. Vì có thể tồn tại các trình tự khác biệt nhưng chúng không
được đặt thành mẫu dò trên mảng [24].
Tính nhạy và đặc hiệu cũng là một tham số rất quan trọng khi sử dụng microarray để nghiên
cứu với các mẫu môi trường. Ở đó, sinh khối hay nồng độ đích thấp và nhiều chất ô nhiễm làm
giảm giới hạn phát hiện [6; 26; 25]. Do đó, một số nhà nghiên cứu đã làm giàu mẫu hoặc sử
dụng PCR để thu được đủ đích đã đánh dấu [27]. Điều này chắc chắn làm thay đổi các điều
kiện môi trường in situ và có thể tác động sâu xa tới biểu hiện gene, thành phần quần xã và cản
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét