Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16s và 23s ribosom rna ở vi khuẩn, ứng dụng cơ sở dữ liệu hai gene 16s và 23s ribosom rna ở vi khuẩn để phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ

iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN

LÊ VĂN TÁM, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY
DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN
– ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI
KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO
MỦ (Bacterial Meningitidis)”
Hội đồng hƣớng dẫn:
– TS. Trần Thị Dung
– Cử nhân Lƣu Phúc Lợi
Khóa luận đƣợc thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 1/2006 đến 8/2006.
Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, một số lƣợng lớn các gene 16S
và 23S rRNA đã đƣợc giải trình tự. Những trình tự gene này đƣợc lƣu trữ trong CSDL
sinh học lớn nhƣ NCBI, EMBL, DDBj…Vì các CSDL này quá lớn và chứa rất nhiều
thông tin khác nhau, không tập trung cho một đối tƣợng cụ thể nên khó có thể thực
hiện việc truy xuất các thông tin phục vụ trực tiếp cho một nghiên cứu chuyên biệt. Do
vậy, mục tiêu của đề tài là tiến hành xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16S và 23S rRNA
ở vi khuẩn và ứng dụng CSDL này để phát hiện các loài vi khuẩn gây bệnh viêm màng
não mủ.
Để đạt đƣợc mục tiêu trên, khóa luận cần đảm bảo thực hiện những nội dung nhƣ
sau:
Dùng Perl script để thu nhận các mẫu tin của hai gene từ trang CSDL GenBank
(CSDL nucleotide của NCBI). Tiếp tục sử dụng Perl script tách các mẫu tin thu
nhận đƣợc thành từng phần riêng biệt nhƣ accession number (mã số truy cập),
gi, definition, sequence (trình tự của gene)…
Thiết kế CSDL dựa vào mô hình dữ liệu quan hệ. Dùng Perl script để chuyển tự
động các thông tin tách đƣợc ở bƣớc trên vào CSDL.
Sử dụng giao thức CGI kết hợp với ngôn ngữ lập trình Perl để thiết kế trang
web CSDL về hai gene 16S và 23S rRNA ở các loài vi khuẩn.

v
Sử dụng trình tự của hai gene 16S và 23S rRNA trong CSDL để thiết kế mồi cho
phản ứng PCR phát hiện và phân biệt các tác nhân gây bệnh viêm màng não
mủ.

Đề tài đã đạt đƣợc những kết quả nhƣ sau:
Đã thu thập đƣợc 2825 mẫu tin về gene 16S rRNA và 305 mẫu tin về gene 23S
rRNA từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
Tạo đƣợc CSDL của hai gene 16S và 23S rRNA tích hợp với web.
Trang web CSDL của hai gene và gồm có 5 trang chính: HOME, SEARCH,
TOOL, LINK, ABOUT. Từ các trang web này, ngƣời sử dụng có thể truy xuất
thông tin, tìm kiếm trình tự, so sánh một trình tự quan tâm với các trình tự trong
CSDL (alignment, BLAST)… Ngoài ra, những trang web chính này còn kết nối
đến những trang phụ khác để cung cấp các tiện ích cho ngƣời dùng.
Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng
não mủ bằng chƣơng trình thiết kế mồi Primrose.



vi
MỤC LỤC

Nội dung Trang
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN iv
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2. MỤC ĐÍCH 2
1.3. YÊU CẦU 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. SƠ LƢỢC VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU 3
2.1.1. Định nghĩa 3
2.1.2. Hệ quản trị CSDL (Database Management System – DBMS) 3
2.1.3. Các mô hình dữ liệu 3
2.2. NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH PERL, MẠNG INTERNET VÀ WEB 3
2.2.1. Perl 3
2.2.1.1. Tóm tắt lịch sử phát triển 3
2.2.1.2. Ứng dụng 4
2.2.1.3. Một số module của Perl thƣờng đƣợc sử dụng 4
2.2.2. Giới thiệu về mạng Internet 5
2.2.3. Tích hợp CSDL với web dùng CGI 5
2.3. CƠ SỞ DỮ LIỆU SINH HỌC 6
2.3.1. NCBI (National Center for Bioinformatic Information) 6
2.3.1.1. Vài nét về NCBI 6
2.3.1.2. Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI 7
2.3.1.3. Một số công cụ trong NCBI 7
2.3.2. EBI (European Bioinformatics Institute) 8

vii
2.3.2.1. Vài nét về EBI 8
2.3.2.2. Một số cơ sở dữ liệu trong EBI 8
2.3.2.3. Một số công cụ hỗ trợ phân tích trình tự sinh học 9
2.3.3. SIB (Swiss Institute of Bioinformatics) 9
2.3.4. DDBJ (DNA Data Bank Japan) và PDBj (Protein Database Japan) 10
2.4. BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 12
2.4.1. Sơ lƣợc về bệnh viêm màng não mủ 12
2.4.1.1. Định nghĩa 12
2.4.1.2. Bệnh theo lứa tuổi 12
2.4.1.3. Các con đƣờng xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh 13
2.4.2. Các triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh 13
2.4.2.1. Những triệu chứng giai đoạn khởi phát 13
2.4.2.2. Biểu hiện lâm sàng của viêm màng não mủ 13
2.4.3. Hậu quả của bệnh trên những đối tƣợng bị lây nhiễm 15
2.4.4. Tình hình bệnh viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam 15
2.5. VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 16
2.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 18
2.6.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng 18
2.6.2. Phƣơng pháp xét nghiệm vi khuẩn học 18
2.6.3. Phƣơng pháp miễn dịch học 19
2.6.4. Phƣơng pháp tế bào học 19
2.6.5. Phƣơng pháp sinh hoá 19
2.6.5.1. Đƣờng trong dịch não tủy 19
2.6.5.2. Đạm trong dịch não tủy 19
2.6.5.3. Phƣơng pháp khảo sát nồng độ lactate 20
2.6.6. Phƣơng pháp chụp cắt lớp – CT (computer tomography) 20
2.6.7. Phƣơng pháp xét nghiệm dựa vào kỹ thuật PCR 20
2.7. KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN
GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 20
2.7.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 20
2.7.2. Quy trình của phản ứng PCR 21
2.7.3. Seminested PCR/ Multiplex PCR 22

viii
2.7.3.1. Seminested PCR 22
2.7.3.2. Multiplex PCR 22
2.7.4. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm
màng não mủ. 22
2.8. GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA 24
2.8.1. RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome 24
2.8.2. Gene 16S rRNA thƣớc đo tiến hóa 25
2.8.3. Gene 23S rRNA 28
2.9. ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ BẰNG KHÁNG SINH 28
PHẦN 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ CÁC CHƢƠNG TRÌNH SỬ DỤNG 29
3.1. CÁC CHƢƠNG TRÌNH VÀ NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH ĐƢỢC SỬ DỤNG 29
3.1.1. Hệ điều hành 29
3.1.2. Các chƣơng trình phân tích trình tự 29
3.1.2.1. Chƣơng trình so sánh trình tự ClustalW 29
3.1.2.2. Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST 30
3.1.3. Hệ quản trị CSDL quan hệ MySQL 30
3.1.4. Apache web server 31
3.1.5. Ngôn ngữ lập trình Perl và các gói sử dụng 31
3.1.6. Chƣơng trình thiết kế mồi Primrose 2.17 32
3.2. PHƢƠNG PHÁP 33
3.2.1. Thu nhận các mẫu tin chứa trình tự và thông tin liên quan của hai gene
16S và 23S rRNA 33
3.2.3. Thiết kế CSDL gene 16S và 23S rRNA 38
3.2.3.1. Phân tích dữ liệu 38
3.2.3.2. Thiết kế CSDL dạng bảng 39
3.2.3.3. Lƣu trữ các thông tin vào CSDL 41
3.2.4. Tích hợp CSDL gene 16S rRNA và 23S rRNA với trang web 42
3.3. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn viêm màng não 42
3.3.1 Thiết kế mồi dựa trên trình tự gene 16S rRNA 43
3.3.2. Thiết kế mồi dựa trên trình gene 23S rRNA 47
3.3.3. Nhiệt độ nóng chảy của mồi 51
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

ix
4.1. Kết quả thu nhận các mẫu tin chứa trình tự và thông tin liên quan của hai
gene 16S và 23S rRNA 52
4.2. CSDL gene 16S và 23S rRNA 52
4.3. Trang web thể hiện thông tin CSDL gene 16S và 23S rRNA 52
4.3.1. Trang thông tin chung về CSDL gene 16S và 23S rRNA (Home Page) 54
4.3.2. Trang tìm kiếm (Search Page) 55
4.3.3. Trang công cụ (Tool Page) 58
4.3.4. Trang Meningitidis 60
4.4. Kết quả thiết kế mồi phát hiện các tác nhân viêm màng màng não mủ 60
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
PHỤ LỤC

x
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ


Trang
Bảng 2.1. Tóm tắt tác nhân gây bệnh theo lứa tuổi 12
Bảng 2.2. Dấu hiệu và triệu chứng của bệnh viêm màng não mủ 14
Bảng 2.3. Các nhóm kháng sinh đặc trị vi khuẩn viêm màng não mủ 28
Bảng 3.1. Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính sinh vật 38
Bảng 3.2. Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính trình tự 39
Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận mẫu tin của hai gene 16S và 23S rRNA 33
Sơ đồ các đối tƣợng chính trong CSDL hai gene 16S và 23S rRNA 38
Sơ đồ chi tiết các bảng quan hệ 40
Sơ đồ cấu trúc các trang web thể hiện thông tin CSDL gene 16S và 23S rRNA 53


xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Tƣơng tác giữa Perl script-DBI-DBD và RBDMS 5
Hình 2.2. Tƣơng quan giữa NCBI, NLM (National Library of Medicine) và NIH 6
Hình 2.3. Một số cơ sở dữ liệu trong EBI 9
Hình 2.4. Ba cơ sở dữ liệu nucleotide (GenBank – EMBL – DDB) và công cụ tìm
kiếm tƣơng ứng 11
Hình 2.5. Sự hợp nhất của ba cơ sở dữ liệu MSD, PDBj, PDB 11
Hình 2.6. Quy trình phản ứng PCR 21
Hình 2.7. Thành phần cấu tạo của ribosome ở prokaryote 25
Hinh 2.8. Vị trí và kích thƣớc của 16S và 23S rRNA trong bộ gene vi khuẩn 27
Hình 3.1. Tìm kiếm bằng từ khóa trong trang Home Page của NCBI 34
Hình 3.2. Trang kết quả tìm kiếm bằng từ khóa cho gene 16S rRNA 34
Hình 3.3. Kết quả tìm kiếm thể hiện ở dạng text 35
Hình 3.4. File text chứa mã số truy cập 35
Hình 3.5. Tất cả mẫu tin của gene 16S rRNA 36
Hình 3.6. Một mẫu tin của gene 16S rRNA có mã số truy cập AB016268 37
Hình 3.7. Thiết kế CSDL ở mức vật lý 41
Hình 3.8. Tiến trình lấy thông tin từ CSDL hai gene ở vi khuẩn 42
Hình 3.9. Tạo CSDL trình tự gene 16S rRNA ở các vi khuẩn viêm màng não mủ 43
Hình 3.10. Chọn trình tự đích trong thiết kế mồi phát hiện Streptococcus pneumoniae
dựa trên gene 16S rRNA. 43
Hình 3.11. Xác định các thông số cho mồi và số lƣợng mồi đƣợc tạo ra trên trình tự
đích 16S rRNA 44
Hinh 3.12. Danh sách các mồi thiết kế đƣợc trên 16S rRNA 44
Hình 3.13. Vị trí bắt cặp của mồi xuôi trên trình tự đích 16S rRNA 45
Hình 3.14. Vị trí bắt cặp của mồi ngƣợc trên trình tự đích 16S rRNA 46
Hinh 3.15. Kiểm tra lại sự bắt cặp của mồi ngƣợc và mồi xuôi trên trình tự đích 16S
rRNA 46
Hình 3.16. Kết quả kiểm tra sự bắt cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc trên trình tự đích gene
16S rRNA 47

xii
Hình 3.17. Danh sách các mồi thiết kế đƣợc cho trình tự gene 23S rRNA ở
Streptococcus pneumoniae 48
Hình 3.18. Vị trí bắt cặp của mồi xuôi trên trình tự đích 23S rRNA 49
Hình 3.19. Vị trí bắt cặp của mồi ngƣợc trên trình tự đích 23S rRNA 49
Hình 3.20. Kiểm tra lại sự bắt cặp của mồi ngƣợc và mồi xuôi trên trình tự đích 23S
rRNA 50
Hình 3.21. Kết quả kiểm tra sự bắt cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc trên trình tự đích gene
23S rRNA 50
Hình 3.22. Tính nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi 16S 51
Hình 4.1. Trang Home Page 54
Hình 4.2. Trang tìm kiếm theo mã số truy cập (accession number) 55
Hình 4.3. Trang kết quả tìm kiếm bằng mã số truy cập 56
Hình 4.4. Trang tìm kiếm theo tên loài (species name) 57
Hình 4.5. Trang kết quả tìm kiếm theo tên loài (species name) 57
Hình 4.6. Trang công cụ sắp gióng cột (Alignment) 58
Hình 4.7. Trang kết quả sắp gióng cột hai trình tự 59
Hình 4.8. Trang công cụ BLAST 59
Hình 4.9. Trang Meningitidis 60
Hình 4.10. Sự bắt cặp của cặp mồi 16S rRNA trên trình tự đích và trình tự ngoài vùng
đích 61
Hình 4.11. Sự bắt cặp của cặp mồi 23S rRNA trên trình tự đích và trình tự ngoài vùng
đích 61







xiii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CSDL Cơ Sở Dữ Liệu
Perl Practical Extraction and Report Language
CGI Common Gateway Interface
DBI Database Interface
DBD Database Driver
WWW World Wide Web
HTML Hypertext Markup Language
HTTP Hypertext Transfer Protocol
NCBI Center for Bioinformatic Information
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
EBI European Bioinformatics Institute
EMBL European Molecular Biology Laboratory
SIB Swiss Institute of Bioiformatics
DDBJ DNA Data Bank Japan
PDBj Protein Database Japan
PCR Polymerase Chain Reaction
rRNA ribosomal RNA

Xem chi tiết: Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16s và 23s ribosom rna ở vi khuẩn, ứng dụng cơ sở dữ liệu hai gene 16s và 23s ribosom rna ở vi khuẩn để phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ